蛹虫草提取物对大气细颗粒物PM2.5致小鼠肺损伤的干预作用

郑 义1，陈安徽1，邵颖1，XX2，XX2

(1.徐州工程学院江苏省食品资源开发与质量安全重点建设实验室，江苏徐州 221000；

2. 江苏康能生物工程股份有限公司，江苏南京 210005)

摘要：目的：观察蛹虫草提取物对PM2.5致小鼠肺损伤的干预作用，为蛹虫草提取物在防治PM2.5致肺损伤中的应用提供理论基础。方法：小鼠随机分为空白对照组、PM2.5（20 mg/kg，鼻腔滴注）染毒组及蛹虫草提取物低中高剂量干预组（50，100，200 mg/kg，灌胃）。收集肺泡灌洗液进行炎性细胞计数；测定灌洗液中酸性磷酸酶 （acid phosphatase, ACP）、碱性磷酸酶（alkaline phosphatase , AKP）、乳酸脱氢酶（lactate dehydrogenase, LDH）活性；测定血清中免疫球蛋白IgA、IgG、IgM、肿瘤坏死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）、白细胞介素（interleukin, IL）-2含量；测定肺组织匀浆上清液总抗氧化能力（total antioxidant capacity, T-AOC）、超氧化物歧化酶（superoxidase dismutase, SOD）、过氧化氢酶（catalase, CAT）、谷胱甘肽过氧化物酶（glutathione peroxidase, GSH-Px）活性及丙二醛（malondialdehyde, MDA）含量。结果：PM2.5染毒能够造成肺泡灌洗液中炎性细胞密度增加，它可以抑制这种改变。PM2.5染毒后，肺泡灌洗液中ACP、AKP、LDH活性升高，不同剂量蛹虫草提取物可以抑制其增加。不同剂量蛹虫草提取物可显著提高PM2.5染毒引起的血清中IL-2、TNF-α、IgA、IgM、IgG水平。PM2.5染毒后，肺组织匀浆上清液T-AOC、SOD、CAT、GSH-Px活性降低，MDA含量升高，它的预处理可以抑制上述改变。结论：PM2.5可对小鼠肺组织造成显著的炎性损伤和氧化损伤，蛹虫草提取物能够减轻该损伤作用。

关键词：蛹虫草提取物；PM 2.5；小鼠；肺损伤；干预作用

大气细颗粒物PM2.5是悬浮于空气中直径小于或等于2.5 μm的颗粒物，成分复杂。流行病学结果表明，大气细颗粒物暴露与慢性阻塞性肺气肿、哮喘和冠状动脉粥样硬化等多种慢性炎症性疾病的发病率和死亡率紧密相关。

蛹虫草 Cordyceps militaris (L.) Fr.在我国作为食药兼用真菌而广泛应用，并有望成为冬虫夏草Ophiocordyceps sinensis (Berk.)的替代品。蛹虫草中富含虫草素、虫草酸、麦角甾醇、多糖等活性成分，具有广泛的药理作用，包括：抗炎、抗菌、抗肿瘤、抗病毒、镇痛、催眠、抗疲劳、抗衰老、抗氧化、抗血管生成，常用于强肾和治疗肺病、缓解性亢奋，降血糖、降血脂、肾功能不全和肝病，有益于人体免疫、造血、心血管、呼吸和内分泌系统等。有报道表明，培植冬虫夏草和野生冬虫夏草均具有促进PM2.5超细颗粒物从斑马鱼体内排出进入肠道排出的作用。但蛹虫草拮抗PM2.5对小鼠肺损伤的研究鲜见报道。因此，本实验通过观察PM2.5染毒对小鼠的肺损伤作用及蛹虫草提取物的干预作用，探讨蛹虫草提取物在PM2.5致小鼠肺损伤中的保护作用，旨在为防治环境污染所致的呼吸道疾病开拓新的思路。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

昆明小鼠，许可证号：SCXK鲁20140007，(20±2) g，济南朋悦实验动物繁育有限公司提供；酸性磷酸酶 （acid phosphatase, ACP）、碱性磷酸酶（alkaline phosphatase , AKP）、乳酸脱氢酶（lactate dehydrogenase, LDH）、免疫球蛋白IgA、IgG、IgM、肿瘤坏死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）、白细胞介素（interleukin, IL）-2、总抗氧化能力（total antioxidant capacity, T-AOC）、超氧化物歧化酶（superoxidase dismutase, SOD）、过氧化氢酶（catalase, CAT）、谷胱甘肽过氧化物酶（glutathione peroxidase, GSH-Px）活性及丙二醛（malondialdehyde, MDA）测试盒购自南京建成生物工程研究所；其他试剂均为国产分析纯。

1.2 仪器与设备

LGJ-18A冷冻干燥机  北京四环科学仪器厂制造；723C可见分光光度计  上海精密科学仪器有限公司；TGL-16台式高速冷冻离心机  湖南湘仪实验室仪器有限公司；iMark酶标仪  伯乐生命医学产品（上海）有限公司。

1.3 方法

1.3.1 蛹虫草提取物的制备

蛹虫草超微粉碎（1000目），加入15倍质量水，加入纤维素酶、半纤维素酶、果胶酶、胰蛋白酶50℃酶解2 h后，才有高压均质机均质（85MPa）处理，喷雾干燥，得到蛹虫草提取物。

1.3.2 PM2.5样品采集和悬液制备

于徐州市非工业区使用大流量采样器采用玻璃纤维滤膜采集大气 PM 2.5（由徐州市产品质量监督检验中心合作完成）。将采集到细颗粒物的滤膜剪成 1 cm×3 cm 细条状，置于去离子水中，使用超声波清洗器洗脱，3000 r/min离心 20 min，4 ℃冷冻真空干燥收集 PM 2.5，保存。临用前，称取一定重量的 PM 2.5，用 0.9%生理盐水配制成相应浓度的 PM 2.5混悬液，超声震荡混匀，4 ℃保存。

1.3.3 实验动物分组及处理

设空白对照组、PM 2.5染毒组（20 mg/kg）、蛹虫草提取物低剂量组（50 mg/kg）、中剂量组（100 mg/kg）和高剂量组（200 mg/kg），每组10 只小鼠，共50 只。每组分别灌胃14 d后，乙醚麻醉小鼠，鼻腔滴注染毒，每组各染毒3 次，每次0.1 mL，每次间隔24 h。PM 2.5染毒组灌胃生理盐水，空白对照组均以无菌生理盐水代替PM 2.5和蛹虫草提取物。

在末次染毒后 24 h内处死动物，眼眶取血后，处死动物。每组小鼠5 只用于炎性细胞分类计数，5 只用于组织样品采集。

1.3.4 肺泡灌洗液（bronchoalveolar lavage fluid，BALF）炎性细胞计数及炎性损伤检测

将小鼠胸腔暴露，以止血钳夹住小鼠左肺叶，剥离支气管，剪开一小口，将灌肺针插入后以手术线结扎，向肺部缓慢注入预冷的生理盐水溶液1 mL，按摩肺部后吸出，重复5 次后收集BALF，回收率大于80%。以生理盐水调整细胞数，取20 μL BALF涂板，置于室温干燥后，瑞氏-姬姆萨法染色计数100 个细胞，计算其中嗜酸性粒细胞、中性粒细胞、淋巴细胞数量。按照说明书检测BALF中ACP、AKP和LDH活性。

1.3.5血清细胞因子与免疫球蛋白检测

眼眶取血，于室温放置30 min 后，3 000 r/min、4 ℃离心10 min，取上清液，按照说明书检测IgA、IgG、IgM、TNF-α、IL-2含量。

1.3.6 肺组织氧化指标检测

取右肺叶0.3 g，剪碎后加入9 倍体积预冷的生理盐水，置于冰上充分匀浆，3 000 r/min、4 ℃离心15 min，取上清液按照说明书测定小鼠T-AOC、SOD、CAT、GSH-Px活性及MDA含量。

2 结果与分析

2.1 小鼠一般生长情况

空白组小鼠毛发光泽度好，体质量逐渐缓慢增长（见表1），呼吸正常。PM 2.5染毒组，小鼠毛发光泽度差，呼吸急促，精神躁动不安。体质量增长缓慢，部分出现体质量下降，体质量增加量显著低于正常组（P < 0.05）。蛹虫草提取物组小鼠毛发光泽度较好，呼吸运动较为平缓。体质量缓慢增长，体质量增加量显著高于PM2.5染毒组（P < 0.05），体质量增加量随着蛹虫草提取物剂量的增加而增大。

表1 各组小鼠体质量变化情况

组别

剂量(mg/kg)

体质量增加量(g)

正常组


4.75±0.42*

PM2.5染毒组

20

0.83±0.25#

蛹虫草提取物低剂量组

50

1.21±0.37*,#

蛹虫草提取物中剂量组

100

3.85±0.31*,#

蛹虫草提取物高剂量组

200

4.26±0.43*,#

结果表示为（n = 10）

* P < 0.05，与PM2.5染毒组小鼠比较

# P < 0.05，与正常组小鼠比较

2.2 PM2.5对小鼠肺组织的炎性损伤作用及蛹虫草提取物的干预作用

2.2.1 PM2.5对炎性细胞的影响及蛹虫草提取物的干预作用

表2为PM2.5对小鼠BALF中炎性细胞的影响及蛹虫草提取物的干预作用。与正常组小鼠相比，PM2.5染毒组BALF中总细胞密度、淋巴细胞密度、中性粒细胞密度、嗜酸性粒细胞密度均显著升高（P＜0.05），表明PM2.5可增加小鼠炎性细胞数量。与PM2.5染毒组相比，它干预组BALF中总细胞、中性粒细胞、淋巴细胞和嗜酸性粒细胞密度明显降低（P＜0.05），表明蛹虫草提取物在一定程度上能够减缓PM2.5对小鼠造成的炎性细胞增殖作用。

表2  PM2.5对小鼠BALF中炎性细胞的影响及蛹虫草提取物的干预作用

组别

剂量(mg/kg)

总细胞密度

(109个/L)

淋巴细胞密度

(109个/L)

中性粒细胞密度

(109个/L)

嗜酸性粒细胞密度

 (109个/L)

正常组


1.89±0.36*

1.24±0.22*

0.52±0.08*

0.79±0.14*

PM2.5染毒组

20

6.82±0.53#

4.67±0.26#

0.94±0.13#

1.62±0.24#

蛹虫草提取物低剂量组

50

4.76±0.51*,#

3.32±0.25*,#

0.85±0.18*,#

1.27±0.31*,#

蛹虫草提取物中剂量组

100

3.59±0.25*,#

2.26±0.18*,#

0.72±0.11*,#

1.04±0.58*,#

蛹虫草提取物高剂量组

200

2.62±0.32*,#

1.59±0.24*,#

0.67±0.15*,#

0.95±0.15*,#

结果表示为（n = 10）

* P < 0.05，与PM2.5染毒组小鼠比较

# P < 0.05，与正常组小鼠比较

2.2.2 PM2.5对小鼠BALF中LDH、AKP和ACP活性的影响及蛹虫草提取物的干预作用

由表3可知，与空白对照组相比， PM2.5染毒可引起小鼠LDH、AKP和ACP活力显著升高（P＜0.05）；相比于PM2.5染毒组，其各自的蛹虫草提取物干预组中LDH、AKP和ACP活力显著降低（P＜0.05）。由此说明，PM2.5能够在一定程度上对小鼠肺组织造成实质性损伤，并且它能够减弱PM2.5对小鼠肺组织造成的毒性作用。

表3  PM2.5对小鼠BALF中LDH、AKP和ACP活性的影响及蛹虫草提取物的干预作用

组别

剂量(mg/kg)

LDH (U/mg pro)

AKP (U/mg pro)

ACP (U/mg pro)

正常组


318.47±34.13*

21.34±4.28*

48.21±6.29*

PM2.5染毒组

20

528.95±42.08#

35.48±8.17#

73.84±8.12#

蛹虫草提取物低剂量组

50

453.74±31.10*,#

30.35±5.72*,#

62.34±7.28*,#

蛹虫草提取物中剂量组

100

386.62±46.07*,#

27.41±3.37*,#

57.32±4.19*

蛹虫草提取物高剂量组

200

345.51±32.09*

24.36±3.53*,#

52.73±5.35*,#

结果表示为（n = 10）

* P < 0.05，与PM2.5染毒组小鼠比较

# P < 0.05，与正常组小鼠比较

2.3 PM2.5对血清免疫球蛋白和细胞因子的影响及蛹虫草提取物的干预作用

2.3.1 PM2.5对TNF-α的影响及蛹虫草提取物的干预作用

表4为PM2.5对小鼠血清TNF-α水平的影响及蛹虫草提取物的干预作用。与空白对照组相比，PM2.5染毒组TNF-α含量显著升高（P＜0.05）；与PM染毒组相比，蛹虫草提取物干预组肺组织中TNF-α含量均显著降低（P＜0.05）。表明它能够减轻PM2.5诱导的促炎性因子TNF-α释放。

表4  PM2.5对小鼠血清TNF-α的影响及蛹虫草提取物的干预作用

组别

剂量(mg/kg)

TNF-α (pg/mL)

正常组


25.58 ± 1.82*

PM2.5染毒组

20

40.26 ± 5.15#

蛹虫草提取物低剂量组

50

35.23 ± 2.32*,#

蛹虫草提取物中剂量组

100

31.67± 3.84*,#

蛹虫草提取物高剂量组

200

28.28 ± 2.26*,#

结果表示为（n = 10）

* P < 0.05，与PM2.5染毒组小鼠比较

# P < 0.05，与正常组小鼠比较

2.3.2 PM2.5对IL-2的影响及蛹虫草提取物的干预作用

PM2.5对小鼠血清IL-2水平的影响及蛹虫草提取物的干预作用见表5。与空白对照组比较，PM2.5染毒组IL-2含量显著升高（P＜0.05），表明IL-2是PM2.5引发小鼠肺部炎性的敏感指标。与PM2.5染毒组相比，蛹虫草提取物干预组血清中IL-2含量显著降低（P＜0.05），表明它在一定程度上能够减弱PM2.5诱导的促炎因子IL-2水平增加。

表5  PM2.5对小鼠血清IL-2的影响及蛹虫草提取物的干预作用

组别

剂量(mg/kg)

IL-2 (pg/mL)

正常组


35.28 ± 2.63*

PM2.5染毒组

20

68.47 ± 3.58#

蛹虫草提取物低剂量组

50

54.65 ± 2.47*,#

蛹虫草提取物中剂量组

100

45.45 ± 2.26*,#

蛹虫草提取物高剂量组

200

38.78 ±2.71*,#

结果表示为（n = 10）

* P < 0.05，与PM2.5染毒组小鼠比较

# P < 0.05，与正常组小鼠比较

2.3.3 PM2.5对免疫球蛋白的影响及蛹虫草提取物的干预作用

表6结果表明，与空白对照组相比，PM2.5染毒组血清中IgA、IgG和IgM显著降低（P < 0.05）。与染毒组相比，蛹虫草提取物干预组血清中IgA、IgG和IgM水平显著提高（P < 0.05）。表明它在一定程度上能够减弱PM2.5导致的免疫球蛋白水平下降。表6 PM2.5对小鼠血清免疫球蛋白的影响及蛹虫草提取物的干预作用

 

组别

剂量(mg/kg)

IgA (g/L)

IgG (g/L)

IgM (g/L)

正常组


1.96±0.23*

9.52±0.58*

2.57±0.17*

PM2.5染毒组

20

0.89±0.64#

6.36±0.33#

1.88±0.32#

蛹虫草提取物低剂量组

50

1.47±0.35*,#

7.52±0.38*,#

2.04±0.37*,#

蛹虫草提取物中剂量组

100

1.69±0.48*,#

8.24±0.61*,#

2.26±0.41*,#

蛹虫草提取物高剂量组

200

1.87±0.34*,#

9.01±0.55*,#

2.52±0.25*

结果表示为（n = 10）

* P < 0.05，与PM2.5染毒组小鼠比较

# P < 0.05，与正常组小鼠比较

组别

剂量

(mg/kg)

T-AOC

(U/mg pro)

SOD

(U/mg pro)

CAT

(U/mg pro)

GSH-Px

(U/mg pro)

MDA

(nmol/mg pro)

正常组


1.24±0.06*

175.32±14.21*

40.54±5.07*

546.24±31.62*

1.57±0.08*

PM2.5

染毒组

20

0.72±0.13#

127.58±10.14#

25.86±3.35#

432.12±27.86#

3.45±0.42#

蛹虫草提取

物低剂量组

50

0.93±0.06*,#

139.36±13.82*,#

30.45±4.51*,#

487.19±32.37*,#

2.83±0.24*,#

蛹虫草提取

物中剂量组

100

1.07±0.11*,#

152.22±14.90*,#

33.87±5.25*,#

506.13±31.55*,#

2.37±0.32*,#

蛹虫草提取

物高剂量组

200

1.13±0.08*,#

165.75±17.56*,#

37.16±4.42*,#

528.44±41.96*,#

1.83±0.18*,#

2.4 PM2.5小鼠肺组织的氧化损伤作用及蛹虫草提取物的干预作用

PM2.5对小鼠肺组织的氧化损伤作用及蛹虫草提取物的干预作用如表7所示。PM2.5染毒组小鼠肺组织T-AOC、SOD、CAT、GSH-Px活性均显著低于正常组（P<0.05），模型组的脂质过氧化产物MDA含量显著高于正常组（P<0.05）。表明PM2.5造成了小鼠肺组织抗氧化防御系统的损伤。蛹虫草提取物各剂量组小鼠肺组织中T-AOC、SOD、CAT、GSH-Px活性显著高于模型组（P<0.05）；它的各剂量组的MDA含量均显著低于PM2.5染毒组（P<0.05）。蛹虫草提取物干预组剂量越高，抗氧化酶上升与MDA下降的程度亦越高。表明蛹虫草提取物在一定程度上能够减弱PM2.5导致的抗氧化酶下降与MDA上升。

表7 蛹虫草提取物对PM2.5致小鼠肺组织T-AOC、SOD、CAT、GSH-Px活性和MDA含量的影响

结果表示为（n = 10）

* P < 0.05，与PM2.5染毒组小鼠比较

# P < 0.05，与正常组小鼠比较

3 结论

蛹虫草提取物能够减弱PM2.5染毒致小鼠体质量的下降。PM2.5染毒能够造成小鼠肺泡灌洗液中淋巴细胞、中性粒细胞和嗜酸性粒细胞等炎性细胞密度增加，它可以抑制这种改变。PM2.5染毒后，肺泡灌洗液中ACP、AKP、LDH活性升高，不同剂量蛹虫草提取物均可以抑制其增加。不同剂量蛹虫草提取物可显著减弱PM2.5染毒引起的血清中IL-2和TNF-α促炎因子水平的上升，减弱IgA、IgM和IgG等免疫球蛋白水平的下降。PM2.5染毒后，小鼠肺组织匀浆上清液T-AOC、SOD、CAT、GSH-Px活性降低，MDA含量升高，蛹虫草提取物干预可以抑制上述改变。综上所述，PM2.5可对小鼠肺组织造成显著的炎性损伤和氧化损伤，蛹虫草提取物能够减轻上述损伤作用。